Le clonage par ligature et digestion par enzymes de restriction est une méthode permettant de déplacer simplement un fragment d’ADN bicaténaire d’un plasmide à un autre.
Un système d’enzymes de restriction et d’enzymes de modification de l’ADN complet pour un clonage en toute simplicité.
Un protocole simple en deux étapes, quel que soit le nombre d’enzymes de restriction au sein de votre réaction ou le type d’ADN que vous utilisez. Il vous suffit de préparer votre mélange de réaction et de l’incuber à 37 °C pendant 15 minutes.
Les enzymes de restriction agissent en coupant l’ADN bicaténaire selon des séquences de reconnaissance à répétition inversée de 4 à 8 paires de base spécifiques. Les produits du clivage d’ADN ont deux types d’extrémités : franches ou saillantes de type 5’ ou 3’.
Quel que soit le type d’extrémité généré dans le cadre d’une digestion par des enzymes de restriction, le clivage de l’ADN produit toujours des fragments dont les terminaisons comportent des groupes d’hydroxyle-3’ et de phosphate-5’. La ligase d’ADN connecte par covalence des terminaisons de phosphates-5’ et d’hydroxyle-3’ d’ADN (ou ARN) duplex en une réaction dépendante de l’APT.
La réparation des extrémités permet de convertir de l’ADN à saillies de 5’ ou 3’ en ADN à extrémités franches phosphorylées de 5’ afin d’obtenir une ligature efficace en vecteurs de clonage à extrémités franches.
La polynucléotide kinase permet d’effectuer la phosphorylation de l’extrémité 5’ de l’ADN et des oligonucléotides. Lors de la préparation de l’ADN pour l’étape de ligature du clonage, l’ADN d’insert ou l’ADN vectoriel doit contenir un phosphate 5’. En général, l’ADN amplifié par PCR est traité avec une PNK T4 afin d’effectuer la phosphorylation de l’extrémité 5’ pour la ligature suivante du clonage.
Les kits de coupe franche d’ADN permettent de convertir l’ADN à extrémités cohésives en ADN à extrémités franches, utilisable dans les réactions des ligatures d’extrémités franches. Ce processus est utile lorsque le vecteur voulu ne contient pas de site de reconnaissance produisant des extrémités franches.
Les polymérases permettent de générer des extrémités franches et/ou d’incorporer de l’ADN marqué.
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